【生化】Chem. Sci.：用于斑马鱼中性粒细胞颗粒动态变化超微特异性实时成像的荧光苯并查耳酮探针
中性粒细胞是哺乳动物非特异性免疫反应的关键组分，具有消化、吞噬和杀菌的作用，其胞浆内含有大量中性细颗粒。这些中性细颗粒与中性粒细胞的生理功能与生长发育密切相关，因而备受研究者的关注。然而，到目前为止还没有特定的荧光活体染色剂来监测生物体内中性粒细胞颗粒的动态。
日前，巴黎第五大学Romain Duval和法国巴斯德研究所Emma Colucci-Guyon基于监测中性粒细胞颗粒动态变化这一研究目标，设计合成了一系列苯并查耳酮荧光探针，并通过表型筛选确定探针HAB为首例斑马鱼幼体的中性粒细胞颗粒特异性小分子示踪剂，同时记录了吞噬作用过程中HAB染色的中性粒细胞颗粒的动态变化。相关成果发表于Chem. Sci.（DOI: 10.1039/c8sc05593a）。
众所周知，有机荧光团通常为推拉电子体系，通过扩展共轭体系，可以使分子具备有效的激发态分子内电荷转移的能力。查耳酮本身并无荧光特性，给电子芳环（B）与烯酮形成共轭结构，芳基羰基（A）在查尔酮结构中作为吸电子基团。作者选取3-氨基苯并查耳酮作为最佳荧光团以构建荧光分子，并预期该分子能显示出最大的荧光强度和红移效应（Figure 1）。
（来源：Chem. Sci.）
作者首先合成了一系列基于查耳酮结构的荧光探针3-8、12和14（Figure 2A）。通过对探针3-8进行光学性质分析，作者发现探针8具有最高的荧光量子产率（Figure 2B）。探针8与探针12和14相比，荧光量子产率明显提高，这是由于萘环是强给电子基团，可以在查耳酮结构中起到修正荧光团的作用，同时在扩展共轭模式时，羰基具有永久性的烯醇化作用。因此，探针8比探针12的荧光更强，且量子产率提高了20倍（Figure 3）。基于探针8良好的光物理性质，作者将其命名为HAB并用于后续的生物测试。
（来源：Chem. Sci.）
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随后，作者对HAB的溶剂效应进行研究（Figure 4）。HAB及其未取代的类似物6表现出显著的溶剂化显色性，在水、生物缓冲液和醇中几乎不发荧光，在极性非质子溶剂（例如乙酸乙酯）中适度发光，在非极性溶剂（例如甲苯）中发强烈的荧光（Figure 4a和4b）。作者在HAB溶液中加入牛血清白蛋白（BSA），随着BSA浓度的增加，荧光光谱发生红移，并且在578 nm处的荧光增强（Figure 4d-f）。作者猜想，尽管HAB在生物缓冲液中荧光较弱，但其与生物体系中的靶向蛋白连接后，荧光有明显的增强。实验结果显示，HAB胞质溶胶和游离形式的膜等在细胞室中显示出较弱或可忽略的荧光，在靶标结合时显示较强荧光。
（来源：Chem. Sci.）
为了验证HAB可以标记斑马鱼胚胎及其幼体内中性粒细胞颗粒，作者进行了斑马鱼活体成像实验。实验结果显示，受精32 h后的斑马鱼胚胎腹侧尾部区域有较弱的荧光，随着斑马鱼的生长，荧光逐渐增强，这是因为巨噬细胞以及中性粒细胞也随着生长（Figure 5）。基于上述实验结果，作者推测HAB可以标记这两类细胞，并且可以随着细胞的生长在细胞内富集。
（来源：Chem. Sci.）
作者进一步探究了HAB对中性粒细胞的标记作用。作者构建含有荧光蛋白（mCherry蛋白）的转基因斑马鱼幼体模型，主要富集在巨噬细胞的mCherry蛋白显示红色荧光，用HAB处理后，HAB的绿色荧光并未与mCherry蛋白的红色荧光重叠；相比而言，主要富集在中性粒细胞中mCherry蛋白的红色荧光与HAB的荧光重叠，这一结果说明，HAB可区分细胞类型并主要标记中性粒细胞（Figure 6a-l）。随后，作者通过DIC显微镜进一步证实了HAB对中性粒细胞颗粒的标记作用，且中性粒细胞颗粒在细胞质中是不断运动的（Figure 6m-p）。
（来源：Chem. Sci.）
接下来，作者利用HAB对中性粒细胞颗粒在吞噬作用中的动态变化进行研究。作者发现在酵母多糖的吞噬作用下，HAB标记的中性粒细胞颗粒聚集到含颗粒的吞噬体中（Figure 7），这一现象与苏丹黑B（SB）标记的含髓过氧化物酶的中性粒细胞颗粒的运动相类似。HAB主要通过可逆的亲电抑制作用靶向细胞内的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶。最后，作者将HAB用于活体外周血液的染色，发现HAB对淋巴细胞、单核细胞、红细胞和血小板的中性粒细胞具有较好的选择性（Figure 9）。
（来源：Chem. Sci.）
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总结：本文作者设计合成了一种基于苯并查耳酮的探针HAB，并将其应用于监测中性粒细胞颗粒在生物活体中性粒细胞内的动态变化，为人体相关生理学和病理学的研究提供了一种新的监测方法。
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